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從大規模裂解物中制備λ噬菌體顆粒

   材料:

 

   1. 緩沖液和溶液:氯仿;NaCl(固體);聚乙二醇(PEG 8000);SM

 

   2. 酶和緩沖液:胰Dnase I (1mg/ml);胰Dnase I (1mg/ml)于TE中(ph7.6)

 

   3. 離心機和轉子:Sorvall  GSA 轉子或相當型號

 

   4. 專(zhuān)用設備:量筒(2L)

 

   5. 載體和菌株:大腸桿菌培養物,經(jīng)λ噬菌體感染和裂解

 

   方法:

 

   用PEG沉淀噬菌體顆粒:

 

   1、將含有λ噬菌體的裂解培養物冷卻至室溫,加胰Dnase I和Dnase 至終濃度約為1μ g/ml,室溫溫育30min。

 

   2、每500ml培養物加入29.2固體NaCl(終濃度為1mon/L),攪拌使其溶解。將培養物冰浴1h。

 

   3、4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA轉子中)離心10min以去除細胞碎片,將四份培養物的上清混合置于2L的干凈量筒中。

 

   4、測定所收集上清的總體積,然后轉移至2L的燒瓶中,加固體PEG至終濃度為10%(m/V,加500ml上清加50gPEG),于室溫用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG。

 

   5、將噬菌體/PEG溶液轉移至聚丙烯離心管中,于冰水浴冷卻,至少放置1h以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀。

 

   6、4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA轉子中)離心10min以回收沉淀的噬菌體,去上清,將離心管倒過(guò)來(lái)傾斜放置5min,以便是剩余液體充分流干。用移液器吸取殘余的液體。

 

   用氯仿抽提細菌碎片:

 

   7、用一帶橡皮球的寬口吸干將噬菌體沉淀輕輕地重懸于SM中(針對步驟3每500ml上清加8ml SM),將離心管傾斜放置,使SM完全覆蓋并浸泡噬菌體沉淀,室溫放置1h。

 

   通過(guò)加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細胞碎片,溫和振蕩30s。4℃,3000g(4300r/min于Sorvall GSA轉子中)離心15min以分離有機相和親水相,回收含噬菌體顆粒的親水相。

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