鏈霉菌孢子懸液的制備

     從已經(jīng)長(cháng)好的固體培養基上用棉簽刮取孢子，使孢子懸浮于離心管中的無(wú)菌水中；將離心管放在振蕩器上盡可能地激烈振蕩1分鐘左右；用裝有脫脂棉的試管過(guò)濾懸液以除去菌絲片段和固體培養基碎片；3000轉/分離心5-10分鐘以使孢子沉淀，停止離心后馬上倒掉上清液；將離心管在振蕩器上振蕩幾秒鐘使孢子沉淀物分散于殘存的一點(diǎn)無(wú)菌水中；加入無(wú)菌的20%甘油于-20℃保存。

      鏈霉菌中NF的證明

     鏈霉菌中的普通致育型因子（NF）能夠產(chǎn)生次甲基霉素，能將旁邊不攜帶NF的鏈霉菌殺死。將待證明鏈霉菌的孢子均勻的涂布在MS培養基表面，待生長(cháng)到開(kāi)始產(chǎn)生孢子和抗生素后，將培養基和表面的鏈霉菌用槍頭制成小圓塊，然后接到新鮮的預先均勻涂布了不具有NF的鏈霉菌孢子MS培養基表面。于30℃培養觀(guān)察是否產(chǎn)生抑菌圈。抑菌圈的大小代表次甲基霉素的含量。

      孢子雜交

     雜交試驗通常在R2YE上進(jìn)行，本實(shí)驗在MS上進(jìn)行（趙麗云）。首先收獲得到兩個(gè)親本LY1和LY2大量的孢子懸液，然后分別將兩親本含有108 的孢子懸液混合均勻后涂布在培養基表面 ,于30℃培養直到產(chǎn)生孢子（4-10天）。按照“鏈霉菌孢子懸液的制備”的步驟收獲雜交后的孢子，得到的雜交后代是一系列基因型不同的重組子群。

在遺傳圖譜上兩個(gè)標記基因之間定位新的基因

     1、選擇合適的兩個(gè)親本：（1）一個(gè)親本帶有新基因，另一個(gè)不帶有，且可用一定的方法區分是否帶有新基因。（2）兩個(gè)親本具有好幾個(gè)互補的遺傳標記，如一個(gè)親本為his+另一個(gè)為his-

     2、將兩個(gè)親本進(jìn)行孢子雜交

     3、重組子基因型的鑒定

     通常，在特定的選擇性培養基上鑒定重組子的基因型，如在親本（1）pro+、his+、arg+、cys+、strS、ura+和親本（2） pro-、his-、arg-、cys-、strR、ura -這兩個(gè)親本菌株-的雜交試驗中，首先將雜交后的孢子涂布在一個(gè)含有脯氨酸（P）、精氨酸（A）、半胱氨酸（C）、鏈霉素（S）和尿嘧啶（U）的MM培養基上，因而就選擇了從親本LY2傳來(lái)的str（鏈霉素抗性）性狀和由親本LY1傳來(lái)的his+（不需要組氨酸）性狀的重組子。然后挑選重組子菌落，用它們生長(cháng)用的同樣的MM培養基制備母平板，待點(diǎn)種區菌落長(cháng)成以后，把母平板再影印到一套五種“診斷培養基”上：（1）ACSU（不加P），（2）PCSU（不加A），（3）PASU（不加C），（4）PACS（不加U），（5）PACSU（對照平板）。復制平板經(jīng)培養以后，每個(gè)重組子的基因型根據它們在每種培養基上是否生長(cháng)而得到鑒定。

     4、遺傳圖譜的制作

     本研究挑選了具有str（鏈霉素抗性）性狀和his+（不需要組氨酸）性狀的重組子172個(gè)，然后影印到五種“診斷培養基”上。172個(gè)重組子在五種“診斷培養基”上得到生長(cháng)情況如下：在（1）ACSU（不加P）上生長(cháng)了40個(gè)重組子；在（2）PCSU（不加A）上生長(cháng)了46個(gè)；在（3）PASU（不加C）上生長(cháng)了54個(gè)重組子；但在（4）PACS（不加U）上卻未發(fā)現有生長(cháng)的重組；,

（5）PACSU（對照平板）172個(gè)重組子都生長(cháng)了。根據172個(gè)重組子在五種“診斷培養基”上得到生長(cháng)情況制作遺傳圖譜。

      LY1（原養型 StrS NF SCE25AT bad-M145衍生菌株）（內圈）與LY2（proA1 hisC9 argA1 cysD18 uraA1strA1 NF SCE25AT bad+1258衍生菌株）（外圈）進(jìn)行孢子雜交，選擇具有strR和his+的性狀的重組子，其它標記用于計數。

     5、在遺傳圖譜上兩個(gè)標記基因之間定位新的基因

     在遺傳圖譜上兩個(gè)標記基因之間定位bad基因的過(guò)程大致如下：將重組子的基因型與親本LY1相比就可知，重組子上哪兩個(gè)標記間的染色體是來(lái)源于另一親本LY2.如果來(lái)源于LY2的那段染色體取代了LY1中含有bad基因的一段染色體，那么得到的重組子就不具有bad基因。在松弛培養中，不具有bad基因的重組子中的bldA基因就可被SCE25AT置換掉，從而顯示“光禿”表型。結合重組子的基因型就可知bad基因在哪兩個(gè)相鄰的標記之間。