1. 在37℃的環(huán)境中培養了16到20 個(gè)小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1 毫升 新鮮的16到20 個(gè)小時(shí)過(guò)夜培養物，轉到一個(gè)含有100毫升 LB培養基的1 L 或500 ml 培養瓶中。于37℃振搖培養約2到3 h（旋轉搖床200~300 r/min），每隔20~30 min測量OD600值≈0.4。

     2. 在無(wú)菌條件下將細菌轉移到一個(gè)，用冰預冷的50 毫升聚丙烯離心管中，冰上放置10~20分鐘。

     3. 于4℃4000轉 /分離心10 分鐘，回收細菌細胞。

     4. 將管倒置1 分鐘，以使最后殘留的痕量培養液流盡。

     5. 以10 毫升 用冰預冷的0.1 mM CaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉 /分離心10 分鐘，回收細菌細胞。

     6. 每50毫升 初始培養物用2毫升冰預冷的0.1 M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。

     7. 用無(wú)菌吸頭從感受態(tài)細胞懸液中取200 μl 轉移到無(wú)菌的微量離心管中，加DNA或連接反應混合物（體積≤10 μl，DNA≤50 ng），輕旋以混勻內容物，冰浴30 分鐘。

     8. 將離心管放到預加溫到42℃的水浴中，90 秒。

     9. 將混合物快速轉移到冰浴中，冷卻1~2分鐘，加入適當的培養基在37 ℃培養45 分鐘，使細胞復蘇，并表達質(zhì)粒所攜帶的轉化基因。

     10. 將適當體積（每個(gè)90 mm平板可達200 μl）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到相應抗生素的平板培養基上。 

     11. 將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養箱中，12~16小時(shí)，平板培養，克隆在此期間應該出現，否則轉化不成功。