實(shí)驗前應明確的問(wèn)題

1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長(cháng)滿(mǎn)時(shí)約有105個(gè)細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行mtt 試驗前，要進(jìn)行預實(shí)驗檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細胞數條件下的生長(cháng)曲線(xiàn)，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時(shí)間，以保證培養終止致細胞過(guò)滿(mǎn)。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線(xiàn)性關(guān)系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀(guān)察不到差異。

2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時(shí)間范圍再細篩。切記!否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。

3. 時(shí)間點(diǎn)的設定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線(xiàn)，曲線(xiàn)什么時(shí)候變得平坦了(到了平臺期)那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應該就是最好的時(shí)間點(diǎn)(因為這個(gè)時(shí)候的細胞增殖抑制表現的最明顯)。

4. 培養時(shí)間。200ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養不夠的話(huà)，細胞會(huì )由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。

5. MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因為細菌 也可以導致MTT比色OD值的升高。

6. 理論未必都是對的。要根據自己的實(shí)際情況調整。

7. 實(shí)驗時(shí)應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜 。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì )影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會(huì )試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

實(shí)驗步驟

貼壁細胞：

1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。

2. 5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿(mǎn)孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設3-5個(gè)復孔.建議設5個(gè)，否則難以反應真實(shí)情況

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。

4. 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5. 終止培養，小心吸去孔內培養液。

6. 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7. 同時(shí)設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜)

懸浮細胞：

1. 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640(無(wú)血清)培養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培養液稀釋 (儲存液100ug/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1：10-1：20);③需檢測物10ul;④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無(wú)菌水填充)。每板設對照(加100ul 1640)。

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過(guò)步驟4)，直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)

4. 離心(1000轉x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。

5. 同時(shí)設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定3復孔。