固定蠕蟲(chóng)的油紅染色
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發(fā)布時(shí)間：2017-07-28
一、材料與試劑
1. 20%多聚甲醛
2. Na2EGTA
3. 三鹽酸亞精胺
4. 亞精胺
5. 1，4-哌嗪二乙烷磺酸鈉pH7.4
6. β-巰基乙醇
7. 油紅
8. 異丙醇
9. 二硫蘇糖醇
10. 0.2 μM 過(guò)濾器
11. Tris堿
12. 鹽酸
13. PBS
14. 瓊脂糖
15. 氯化鈉
16. 氯化鉀
17. Na2HPO4·7H2O
18. KH2PO4
19. NaOH
二、設備
1. EppendorfThermomixer混合器
2. 臺式離心機
三、步驟
1. 使用1×PBS收集所需生長(cháng)時(shí)期的蠕蟲(chóng)，轉移到15 ml 錐形管中。如果使用的是成蟲(chóng)采用重力法收集或是幼蟲(chóng)期蠕蟲(chóng)采用在1 000 g 減慢旋轉30秒。
注意：確保收集足夠的（~200-500）蠕蟲(chóng)因為在這個(gè)過(guò)程中將喪失一些蠕蟲(chóng)。
2. 吸出上清，用10 ml 1×PBS洗滌，采用步驟1中的重力收集法或是減慢旋轉收集法。
3. 二次洗滌之后，棄大部分上清剩余400 μl 并轉移到1.5 ml Eppendorf管中。
4. 固定。加入500 μl 2×MRWB（新鮮配制）和100 μl 20%多聚甲醛到含有溶解于1×PBS的400 μl 樣品的管中。輕柔的顛倒管混勻溶液，室溫下固定30分鐘，同時(shí)在EppendorfThermomixer混合器上輕柔的搖晃（x1000 rpm）（每5~8分鐘顛倒管無(wú)需搖晃）。
5. 使用1 ml Tris-Cl緩沖液沖洗二次（100 mM，pH7.4）。在這二次沖洗之間，臺式離心機在1，500 g 下減慢旋轉30秒。
6. 在第二次沖洗之后，棄上清留下100 μl，加入900 μl 還原緩沖液[100 mM Tris-Cl pH7.4，10 mM DTT（1.54 mg in 1 ml）]。輕柔的顛倒混合管，室溫下輕柔的搖晃還原30分鐘。
7. 1 500 g 下離心30秒沉淀蠕蟲(chóng)。
8. 利用500 μl 1×PBS洗滌并于1 500 g 減慢旋轉30秒。
9. 吸出上清至管中剩余300 μl，加入700 μl 異丙醇，輕緩的顛倒混合管，置于室溫下輕柔的搖晃15分鐘。
10. 在1 500 g 轉速下減慢旋轉30秒收集。
11. 吸出所有異丙醇，加入油紅染料溶液。
12. 油紅染液的制備：0.5 g 油紅溶解于無(wú)水異丙醇中。室溫下通過(guò)攪拌溶解平衡染液二天。
13. 使用前15分鐘，4體積的雙蒸水和6體積的染液溶液混合，室溫下放置15分鐘?；旌弦猴@現出霧狀。
14. 使用0.2μM孔徑大小的過(guò)濾器過(guò)濾溶液，過(guò)濾液應該是清澈透明的。
15. 加入1 ml 60%過(guò)濾染液至蠕蟲(chóng)中。室溫下置于Thermomixer混合器中（×700 rpm 搖晃或是轉子旋轉）過(guò)夜。
16. 在1 200 g 下減慢旋轉30秒沉淀蠕蟲(chóng)。
17. 吸出盡可能多的染液，并用1×PBS洗滌一次。
18. 直接利用瓊脂糖墊將蠕蟲(chóng)固定在載玻片上（2%1×PBS溶解的瓊脂糖）
注意：保持載玻片在濕度容器中以防止樣品干燥。
(本文轉載丁香通)
