經(jīng)常提質(zhì)粒嗎？熟練之后，提質(zhì)粒乃至質(zhì)粒構建都很簡(jiǎn)單。但如果真問(wèn)起一些質(zhì)粒的細節，可能很多人回答不了。不信隨我看看。

質(zhì)粒組成要素

一個(gè)合格的質(zhì)粒含有以下組成部分：

       復制起始位點(diǎn) Ori 即控制復制起始的位點(diǎn)。原核生物 DNA 分子中只有一個(gè)復制起始點(diǎn)。而真核生物 DNA 分子有多個(gè)復制起始位點(diǎn)。

       抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如 Amp+ 、Kan+。

       多克隆位點(diǎn) MCS 克隆攜帶外源基因片段

       P/E 啟動(dòng)子/增強子

       Terms 終止信號

       加 poly（A）信號 可以起到穩定 mRNA 作用

如何閱讀質(zhì)粒圖譜

       第一步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類(lèi)型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）。

       第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

       Ampr 水解β－內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

       tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細胞。

       camr 生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

       neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418（長(cháng)那霉素衍生物）失活

       hygr 使潮霉素β失活。

       第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì )導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

       第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般來(lái)說(shuō)，外源 DNA 片段越長(cháng)，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

       第五步：是否含有表達系統元件，即啟動(dòng)子－核糖體結合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉錄終止信號。這是用來(lái)區別克隆載體與表達載體?？寺≥d體中加入一些與表達調控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗目的為準繩。

       啟動(dòng)子－核糖體結合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉錄終止信號

       啟動(dòng)子－促進(jìn) DNA 轉錄的 DNA 順序，這個(gè) DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開(kāi)始轉錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉錄。

       增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過(guò)程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無(wú)關(guān)。即在所調控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。

       核糖體結合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個(gè)結合位點(diǎn)，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

       轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。結構基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這 2 部分共同構成 poly（A）加尾信號。

       為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

如何選擇載體

       把一個(gè)有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過(guò)基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

       P.S. 基因工程所用的 vector 實(shí)際上是 DNA 分子，是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細胞的 DNA。

       選擇載體主要依據構建的目的，同時(shí)要考慮載體中應有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構建的目的是要表達一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

載體選擇主要考慮下述 3 點(diǎn)：

       1. 構建 DNA 重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

       2. 載體的類(lèi)型：

       克隆載體的克隆能力－據克隆片段大?。ù筮x大，小選?。?。如<10kb 選質(zhì)粒。

       表達載體據受體細胞類(lèi)型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類(lèi)細胞表達載體。

       對原核表達載體應該注意 3 點(diǎn)：選擇合適的啟動(dòng)子及相應的受體菌；用于表達真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服 4 個(gè)困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應載體的參考。

       3. 載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。

       選用質(zhì)粒（最常用）做載體的 4 點(diǎn)要求：

       選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5 kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）；

       一般使用松弛型質(zhì)粒在細菌里擴增不受約束，一般 10 個(gè)以上的拷貝，而嚴謹型質(zhì)粒 < 10 個(gè)。

       必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；

       必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。

       無(wú)論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當的限制酶將載體 DNA 進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。

       （本文轉載丁香通）