細胞原代培養的目的是為研究生物體細胞的生長(cháng)、代謝、繁殖提供有力的手段,為傳代培養創(chuàng )造條件,服務(wù)于臨床實(shí)踐,用于藥物篩選等。
實(shí)驗材料
胎鼠 新生鼠
試劑、試劑盒
1640培養基 牛血清 胰酶 Hank’s液碘酒儀器、耗材
培養箱 培養瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿吸管 移液管 紗布 手術(shù)器械 血球計數板 離心機 水浴箱
實(shí)驗步驟
1. 加入3-5 ml培養液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
2. 靜置5-10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
3. 1 000 rpm,離心10分鐘,棄上清液。
4. 加入Hank’s液5 ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
5. 加入培養液1-2 ml(視細胞量),血球計數板計數。6. 將細胞調整到5×105/ml左右,轉移至25 ml細胞培養瓶中,37℃下培養。
注意事項
1. 自取材開(kāi)始,保持所有組織細胞處于無(wú)菌條件。細胞計數可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。
2. 在超凈臺中,組織細胞、培養液等不能暴露過(guò)久,以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞,以防止細菌落入。
4. 操作前要洗手,進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
5. 點(diǎn)燃酒精燈,操作在火焰附近進(jìn)行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(cháng),以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過(guò)營(yíng)養液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動(dòng)作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動(dòng),增加污染機會(huì )。
7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
8. 瓶子開(kāi)口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
實(shí)驗方法原理
將動(dòng)物機體的各種組織從機體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養基中培養,使細胞得以生存、生長(cháng)和繁殖,這一過(guò)程稱(chēng)原代培養。因此,較為嚴格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養,此時(shí)的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì),如果是正常細胞,仍然保留二倍體數。但實(shí)際上,通常把第一代至第十代以?xún)鹊呐囵B細胞統稱(chēng)為原代細胞培養。最常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養