基因打靶細胞系的制備及應用
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發(fā)布時(shí)間：2017-09-08
近年來(lái)，基因編輯技術(shù)已經(jīng)得到了迅速的發(fā)展。CRISPR- Cas9 作為第 3 代人工核酸內切酶系統，是一種具有廣闊應用前景的基因定點(diǎn)修飾工具。利用的 CRISPR- Cas9 系統建立基因敲除的細胞系，具有時(shí)間短、難度低、費用少等優(yōu)點(diǎn)，是廣大科研工作者的好幫手。
1、基因打靶細胞系制備的基本原理
基因打靶是指通過(guò) DNA 定點(diǎn)操作，改變基因組中的特定基因的編碼序列，從而在細胞或生物活體內研究基因的功能及干預。細胞系基因打靶最常見(jiàn)的是基因敲除，其原理是：基因組靶序列經(jīng) CRISPR-Cas9 切割后在缺乏修復模板的情況下，主要以非同源重組的方式進(jìn)行修復，會(huì )在切割位點(diǎn)插入或刪除一些堿基，引入移碼突變，從而導致基因不能表達有功能活性的蛋白。
2、基因打靶細胞系的應用
基因打靶細胞系在基因功能研究、人類(lèi)生理病理機制研究及新藥研發(fā)中起著(zhù)非常重要的作用。
（1）基因功能研究
相比于基因過(guò)表達和 Knock-down 的細胞系，基因打靶的細胞系往往表型更加顯著(zhù)，這樣對于闡明基因的功能往往更有幫助。一些基因的敲除，甚至出現細胞致死的現象。碰到這樣的問(wèn)題，可以采用誘導性的基因打靶方案來(lái)解決。
了解基因的功能， 對于提高人類(lèi)對自身疾病、衰老、進(jìn)化、種族血緣等生命現象及其本質(zhì)的認識， 疾病的診斷、預防和治療，克服生存障礙，提高生存質(zhì)量，都有非常重要的意義。
（2）藥物篩選
近年來(lái)，隨著(zhù)基因編輯技術(shù)的日益興盛，基因編輯的疾病動(dòng)物模型在藥物篩選中起到越來(lái)越重要的作用。例如通過(guò)基因打靶技術(shù)構建的高度免疫缺陷的 NSG、NCG 等小鼠，用于構建 PDX 模型。同時(shí)，基因編輯的細胞模型，在腫瘤、免疫、抗體篩選等領(lǐng)域，也有廣泛的應用前景。
（3）細胞治療
目前最熱門(mén)的細胞治療技術(shù)，如 CAR-T,PD-1 基因敲除 T 細胞等，都用到細胞基因打靶技術(shù)。Crispr-Cas9 系統的便捷性、通用性、以及可對多個(gè)目標進(jìn)行基因編輯，在細胞治療領(lǐng)域有極廣的應用前景和可能。
3、基因打靶細胞系的制備方法
（1）基因打靶載體的構建；
（2）細胞轉染與篩選；
（3）細胞的測序鑒定；
（4）單克隆的篩選與鑒定
1. SgRNA 的設計、合成與克隆
2. 細胞轉染與篩選
3. 混合樣品的測序鑒定
（本文轉載丁香通）
