重組子的檢測
發(fā)布人：admin
瀏覽次數：1063
發(fā)布時(shí)間：2017-09-08
[ 實(shí)驗目的 ]
通過(guò)本實(shí)驗學(xué)習 PCR 反應的基本原理與實(shí)驗技術(shù)。
通過(guò)本實(shí)驗學(xué)習重組質(zhì)粒的檢測技術(shù)。
[ 基本原理 ]
聚合酶鏈反應（ polymerase chain reaction ， PCR ）是體外酶促合成特異 DNA 片段的一種技術(shù)。在待擴增的 DNA 片段兩側和與其兩側互補的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后， DNA 擴增 2 n 倍。
PCR 進(jìn)行的基本條件是：
（ 1 ）以 DNA 為模板（在 RT － PCR 中模板是 RNA ）；
（ 2 ）以寡核苷酸為引物；
（ 3 ）需要 4 種 dNTP 作為底物；
（ 4 ）有 Taq DNA 聚合酶。
PCR 每一個(gè)循環(huán)由三個(gè)步驟組成：
（ 1 ）變性 加熱模板 DNA ，使其解離成單鏈；
（ 2 ）退火 降低溫度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低溫條件下與模板 DNA 所需擴增序列結合；
（ 3 ）延伸 在適宜溫度下， Taq DNA 聚合酶利用 dNTP 使引物端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補的 DNA 鏈。
每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因此通過(guò) 35 個(gè)循環(huán)后，目標 DNA 片段可能性擴增可達 2 35 倍。
[ 器材 ]
1 ． PCR 擴增儀 2 ．掌式離心機 3 ． 0. 2ml PCR 管
[ 試劑 ]
1 ． Taq DNA 聚合酶
2. 10×PCR 反應緩沖液
3. 2. 5 mmol/L dNTP
4. 50 mmol/L MgCl 2
5. 模板 DNA
6. 上游引物
7. 下游引物
8. 標準 DNA
[ 實(shí)驗步驟 ]
1. 以質(zhì)粒 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴增。 PCR 反應總體積為 20 μl ，反應液組成：
2. PCR 反應程序設定為： 94℃ ，預變性 5 min ； 94℃ 變性 1 min ， 66℃ 退火 30 s ， 72℃ 延伸 1 min ；共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；最后 72℃ ，延伸 10 min 。
3. 擴增完畢，取 10 μL 用 1. 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴增結果。
（本文轉載丁香通）
