MEF小鼠胚胎成纖維細胞知識總結
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發(fā)布時(shí)間：2017-09-30
小鼠胚胎成纖維細胞的富集
1、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當鼠麻醉后，實(shí)施斷頸法處死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮膚向后拉，暴露出腹膜。用消毒過(guò)的工具，剪開(kāi)腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪開(kāi)每一測的胚囊,并將胚胎移到培養皿中。
4、用兩副鐘表鑷子將胎盤(pán)和膜與胚胎分離開(kāi)，分離后切除內臟（所有深色的東西）。將胚胎轉移到(有蓋)培養皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。
5、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當你剪的很累以致于不能再剪的時(shí)候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA繼續剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大約20分鐘。此時(shí)，返回至第一步，對下一只鼠進(jìn)行操作。
6、執行1－4步，到將胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中這一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的組織物殘留。將皿放回培養箱再孵育10分鐘。
8、用20ml培養基以終止胰蛋白酶/EDTA的消化，將皿中的物質(zhì)轉移至50ml錐形管中。
9、混勻管內的物質(zhì)，加入到含有20ml培養基的T75培養瓶中。每個(gè)培養瓶中裝大約3個(gè)胚胎。
10、將這些培養瓶放在培養箱中37℃培養過(guò)夜。
11、將胚胎置于PBS中，并重復第5步。
12、第二天更換培養基，以去除碎片和中毒的細胞及其分泌的物質(zhì)。
13、當培養瓶中的細胞長(cháng)到80-90%匯合時(shí)并仍處于指數生長(cháng)期時(shí)，是凍存細胞的最佳時(shí)期。一般說(shuō)來(lái)，這發(fā)生在準備胚胎的第二天。這可能或早或晚發(fā)生，所以請注意觀(guān)察你的培養瓶。
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我們已用CF－1品系的鼠制備了成纖維細胞。
培養基成分：88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 雙抗
對于新建立的細胞系，要對樣本進(jìn)行支原體檢測。
小鼠胚胎成纖維細胞的消化/傳代
1、移去MEF培養基
2、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3、每個(gè)培養瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
4、為了使細胞分散開(kāi)，輕輕吹打細胞。
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培養基以終止胰蛋白酶的消化。
6、將細胞懸液加入到15ml的錐形管中，吹打幾次，使細胞分散為單個(gè)的。
7、在新的T75培養瓶中加入10mlMEF培養基。
8、將細胞懸液分裝到新的T75培養瓶中，放在37℃培養箱中進(jìn)行培養。
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MEF培養基成分：
89% DMEM (Gibco # 12100-046)
10% FBS (Gibco # 16000-044)
1% NEAA (Gibco # 11140-050)
MEF每傳一代就會(huì )生長(cháng)得更慢些。你第一次傳代的比例可以是1:5，但是最后一次的傳代（第4代或第5代）比例應該是1:2。
小鼠胚胎成纖維細胞的凍存
重懸培養基：
80% DMEM
20% FBS
1% NEAA
凍存培養基：
60％ DMEM
30％ FBS
20％ DMSO
1、用不含鈣鎂離子的PBS洗一次細胞。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大約5min。
3、將細胞吹打下來(lái)。
4、加入與胰蛋白酶/EDTA等體積的培養基以終止胰蛋白酶的消化。
5、吹散大塊組織。如果還有大塊組織存在，可將懸液加入到50ml的管中使其沉淀。
6、取上清液，將其分裝到錐形管中，1000rpm離心5min。
7、每個(gè)凍存瓶中加入0.5ml（凍存液的一半體積）的重懸培養基重懸細胞。
8、逐滴加入等體積的（0.5ml/瓶）凍存培養基，混勻?，F在DMSO的濃度是10％。
9、每個(gè)凍存瓶中加入1ml的細胞。
10、迅速將細胞轉移到凍存的容器中，-70℃凍存過(guò)夜。（細胞不能長(cháng)時(shí)間放置在室溫而含有DMSO的情況下）
11、第二天將細胞放于液氮中長(cháng)期保存。
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提前標注好凍存細胞的以下信息：
細胞系名稱(chēng)
傳代的代數
凍存細胞的數目
日期
Initials
注明凍存/解凍形式
小鼠胚胎成纖維細胞的解凍/復蘇
1、將凍存瓶從液氮中取出。
2、放在37℃水浴中快速解凍，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.
3、當僅還有一點(diǎn)冰晶殘留時(shí)，用95％的乙醇消毒凍存瓶的外面，并將其置于hood中。（為什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）
4、輕輕地上下翻轉細胞一次，將它們放入15ml錐形管中。
5、想管中逐滴加入10ml培養基。這一步操作不能少于兩分鐘。做快了對細胞將是一種打擊，你將得到比其他方法具有更低生活能力的細胞。
6、1000rpm離心5min。
7、將細胞重懸于10ml培養基中，然后放入T75培養瓶中。
8、放入37℃培養箱。
9、注明凍存/解凍的形式，以更新數據。
（本文轉載：丁香通）
