問(wèn)題:最近要做CHIP,有一點(diǎn)疑惑:如果超聲過(guò)程正好把目的基因斷開(kāi),PCR時(shí)應該就檢測不到目的基因了??!有這樣的情況嗎?
解答:1. 超聲要摸條件,使DNA 片段大都控制在300-500bp(其實(shí)200-800bp也可以的),太小了基本都打斷了,沒(méi)法PCR。2. 設計PCR引物時(shí),產(chǎn)物的長(cháng)度不要太長(cháng)100多就可以,產(chǎn)物太長(cháng)不容易P出來(lái)(原因可能就像你想的那樣,DNA被打斷了)3. 不同的細胞,不同的固定條件,特別是不同的儀器都不一樣的,只能慢慢摸條件,我做ChIP實(shí)驗,在超聲這個(gè)地方浪費的時(shí)間最多了你說(shuō)你的條帶是100左右,你可以試試:
(1)降低振幅和超聲次數(減低的幅度大點(diǎn))
(2)你確定100bp不是RNA(你電泳前去RNA了嗎?),在上樣孔前面有沒(méi)有條帶呀(除了超聲過(guò)了之外,還有可能超聲不足,我當時(shí)就這樣)
問(wèn)題:最近摸超聲條件摸了好一陣子了,感覺(jué)條帶片段差不多了,怎么做input卻擴不出目的基因呢?我的目的基因是318kb,但同時(shí)我用其它引物,產(chǎn)物長(cháng)度分別為500和800的都能擴出來(lái),唯獨想做的目的基因擴不出來(lái),怎么回事呢?用未超聲的細胞,目的基因的引物是沒(méi)有問(wèn)題的,超聲后怎么做不出來(lái)了呢?有這 樣的情況嗎?
解答:未超聲的細胞能作出來(lái),說(shuō)明引物和PCR條件是沒(méi)有問(wèn)題的說(shuō)明是input出了問(wèn)題(input應該是提了DNA才跑的pcr,不是input直接pcr吧?),而input也就只是超聲處理了,說(shuō)明還是這里出的問(wèn)題,你超聲后片段一般都是多大(超聲后直接電泳的,還是提DNA后電泳看的)?可以上個(gè)圖看看嗎?我個(gè)人感覺(jué)318bp的產(chǎn)物有點(diǎn)大了,100多點(diǎn)就可以,,你說(shuō)別的產(chǎn)物500/800多能跑出了,這個(gè)說(shuō)明不了太大的問(wèn)題,畢竟不是一個(gè)基因。