PCR和克隆是我們十分熟悉的技術(shù)，熟悉到我們都有些陌生了，不清楚最新的進(jìn)展。其實(shí)，方法開(kāi)發(fā)者一直在努力擴大其用途，近年來(lái)也有一些讓人吃驚的結果。那么，這些經(jīng)過(guò)時(shí)間考驗的技術(shù)又將會(huì )帶來(lái)一個(gè)怎樣的未來(lái)？也許會(huì )是更大、更快、更小。

    1. 更大。你想要將一個(gè)DNA片段插入載體中？沒(méi)問(wèn)題。那么兩個(gè)片段呢？好吧，難一點(diǎn)，但是也能做到。那五個(gè)怎么樣？如今我們正走入一個(gè)灰色地帶；這可能需要一些時(shí)間。隨著(zhù)研究人員在合成生物學(xué)等領(lǐng)域的研究愈加深入，他們需要一些克隆方法，以一種簡(jiǎn)單的方式插入多個(gè)DNA片段，比如不依賴(lài)于連接的克?。↙IC）或Gibson拼接。

    Gibson拼接是JCVI的Daniel Gibson在2009年發(fā)明的新方法。它利用核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶進(jìn)行拼接，需要相鄰的具有重疊序列的DNA片段。核酸外切酶從5’ 端降解核苷酸，且不與DNA 聚合酶競爭。雙鏈DNA 被消化產(chǎn)生突出的單鏈DNA，重疊序列特異性退火，此時(shí)，外切酶逐漸熱失活。DNA聚合酶和DNA連接酶修復連接成完整的雙鏈 DNA分子，從而實(shí)現無(wú)痕拼接。這種技術(shù)非常高效，而我們有理由相信，2014年在大規?；蚱唇由嫌懈喔倪M(jìn)。

    2. 更快。PCR需要時(shí)間。我們需要反復的變性、退火和延伸，才能產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物用于分析。但如果這一過(guò)程能夠加快而不影響質(zhì)量呢？在過(guò)去幾年，隨著(zhù)DNA聚合酶和PCR儀器的改造，PCR技術(shù)已經(jīng)變得越來(lái)越快。然而，隨著(zhù)人們對個(gè)性化醫療和基因檢測的興趣日益增加，也希望看到新的快速且高質(zhì)量的PCR方法。目前，許多新的測序策略都依賴(lài)重新改造的聚合酶，這也預示著(zhù)迷你PCR的革命。2014年，我們有望看到這些重新改造的聚合酶的更多應用，包括更快的PCR循環(huán)條件，更小、可移動(dòng)的儀器，將PCR從傳統實(shí)驗室的局限中解放出來(lái)。

    3. 更小。近兩年，單細胞成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管我們有大量關(guān)于細胞群體的數據，但我們對單個(gè)細胞的行為還是知之甚少，比如它如何應對特定的刺激。在2013年，許多研究都關(guān)注單細胞水平的生物學(xué)，而研究人員也熱衷于每次對一個(gè)細胞進(jìn)行研究。

    盡管單細胞分析存在不少挑戰；起始材料的量太少，很難確保只有單個(gè)細胞。但隨著(zhù)新技術(shù)的出現，如數字PCR和微滴式數字PCR，以及微流體技術(shù)的改進(jìn)，研究人員也開(kāi)始實(shí)現單細胞生物學(xué)的探索。到2014年，我們預計單細胞應用的數量會(huì )激增，而適用于單細胞的PCR方法也會(huì )如雨后春筍般冒出來(lái)，帶來(lái)新的生物學(xué)發(fā)現。

    今年是PCR技術(shù)的“三十歲生日”。這些年來(lái)，從PCR到定量PCR再到數字PCR，技術(shù)在不斷發(fā)展，也帶來(lái)更廣泛的應用。下一個(gè)三十年，也許PCR會(huì )給我們帶來(lái)更多驚喜。