隨著(zhù)測序成本的直線(xiàn)下降，解讀一個(gè)生物的基因組正在逐漸成為研究者們的日常工作。然而，并不是所有細胞都能夠達到測序要求，測序一般需要幾千到一百萬(wàn)細胞。舉例來(lái)說(shuō)，如果你研究的是早期胚胎發(fā)育，那么可用的細胞數量就很少。

     在這種情況下每一個(gè)細胞都很寶貴，新加坡A*STAR分子與細胞生物學(xué)研究院的Daniel Messerschmidt說(shuō)。為了研究早期胚胎中的表觀(guān)遺傳學(xué)修飾，Messerschmidt及其同事開(kāi)發(fā)了一個(gè)能夠在單細胞中分析DNA甲基化的新技術(shù)。這項發(fā)表在Science雜志上的成果，使Messerschmidt成為了單細胞表觀(guān)遺傳學(xué)領(lǐng)域的先行者。（原文：Single-cell DNA-methylation analysis reveals epigenetic chimerism in preimplantation embryos）

     除了研究稀少細胞中的基因表達，單細胞表觀(guān)遺傳學(xué)檢測技術(shù)還有著(zhù)很大的應用空間，比如說(shuō)可以用來(lái)研究細胞異質(zhì)性很大的腫瘤。發(fā)育早期的表觀(guān)遺傳學(xué)錯誤能夠影響終生，很可能引發(fā)疾病。另外，健康組織中也存在著(zhù)表觀(guān)遺傳學(xué)多樣性。“以往的生物學(xué)教條是，我們從父母繼承到的基因組在所有細胞里是始終如一的，”單細胞基因組學(xué)專(zhuān)家，Leuven大學(xué)副教授Thierry Voet說(shuō)，但現在這一觀(guān)點(diǎn)已經(jīng)被顛覆。

     The Scientist最近撰文詳細介紹了單細胞表觀(guān)遺傳學(xué)研究中的一些關(guān)鍵技術(shù)。這些技術(shù)可以幫助我們在單個(gè)細胞中檢測DNA、組蛋白和染色質(zhì)水平上的表觀(guān)遺傳學(xué)修飾。

     分離單細胞

     在進(jìn)行單細胞表觀(guān)遺傳學(xué)分析之前，你需要先確定自己拿到了正確的細胞或細胞類(lèi)型。

     如果你想要的細胞已經(jīng)處于懸浮狀態(tài)（比如循環(huán)腫瘤細胞），而且含量相對比較豐富，那么流式細胞分析將是你的理想選擇。如果你的樣本是實(shí)體組織，那么可以用酶分解掉膠原和其他細胞外蛋白。不過(guò)酶學(xué)消化對細胞影響較大，甚至可能改變基因轉錄情況，Voet提醒道。在把組織細胞制成懸液之后，我們就可以通過(guò)特異性的熒光標簽分離出自己想要的細胞。進(jìn)一步深入單細胞是比較棘手的一步，可能需要用到微流體設備，尤其是在細胞量較少的時(shí)候。

     將細胞分散到懸液中，會(huì )失去它們在組織里的位置信息。如果你想要了解單個(gè)細胞的鄰居和環(huán)境線(xiàn)索，你就需要使用激光捕獲顯微切割技術(shù)。這種技術(shù)可以通過(guò)掃描組織切片，定位你想要研究的細胞，并將其提取出來(lái)。操作者需要非常小心，不要切到目的細胞流失含有RNA的細胞質(zhì)，或者切掉部分細胞核，Voet指出。

     數量最為稀少的細胞只能用毛細管等器具手動(dòng)獲取。分離到細胞之后，我們就可以進(jìn)行表觀(guān)遺傳學(xué)分析了?，F有技術(shù)一次只能進(jìn)行一種類(lèi)型的單細胞表觀(guān)遺傳學(xué)分析，你需要決定自己研究的是DNA、組蛋白還是染色質(zhì)水平上的標簽。

     甲基化標簽

     DNA的胞嘧啶甲基化是一種經(jīng)典的表觀(guān)遺傳學(xué)標簽，這種標簽通常意味著(zhù)被沉默的基因組區域。之前人們一直在用重亞硫酸鹽測序來(lái)進(jìn)行甲基化分析，這是一種相當嚴酷的化學(xué)方法，主要是把所有未甲基化的胞嘧啶轉變?yōu)槟蜞奏?。?jīng)過(guò)PCR富集，這些改變用二代測序很容易檢測出來(lái)。近來(lái)，一些研究團隊將這一技術(shù)發(fā)展到了單細胞水平。

     Babraham研究所的Gavin Kelsey和Wolf Reik等人，開(kāi)發(fā)了能分析單細胞中所有DNA甲基化的方法。為此，他們需要克服重亞硫酸鹽處理造成的遺傳物質(zhì)損失。研究人員并沒(méi)有像通常那樣先片段化DNA，而是對單個(gè)細胞的裂解物進(jìn)行重亞硫酸鹽轉化。然后他們對得到的DNA片段進(jìn)行五次擴增以增加拷貝數。 “我們得到了很理想的單細胞甲基化圖譜，” Kelsey說(shuō)。

     這個(gè)方案需要不少手動(dòng)操作，但并不比常規重亞硫酸鹽測序難多少。操作者們需要注意的主要問(wèn)題是，每一步操作都有可能引入錯誤。Kelsey建議大家運行大量陰性對照，當你遇到問(wèn)題的時(shí)候，就能很方便的找出問(wèn)題所在。

     Messerschmidt開(kāi)發(fā)的檢測法也是以重亞硫酸鹽測序為基礎的，不過(guò)檢測的是特定位點(diǎn)的甲基化。他們通過(guò)限制性?xún)惹忻赶?，?lái)分離含有目的基因的片段，去除其他無(wú)關(guān)DNA。這是因為，重亞硫酸鹽測序可能降解你想要分析的DNA，而這種方法能夠避開(kāi)這個(gè)問(wèn)題生成更準確的結果，但是一次只能分析少數幾個(gè)基因。“從某種意義上看，這其實(shí)比較像是一種診斷分析，”Messerschmidt說(shuō)。Messerschmidt的方法可以更快得到結果，可以用來(lái)進(jìn)行IVF胚胎篩選。當然，這一方案也可以用于其他數量稀少的細胞，比如小腸隱窩中的成體干細胞。

     在使用這一方法時(shí)，裂解細胞需要非常小心，確保“不要都弄到管壁上”，Messerschmidt提醒道。“否則，液體快速蒸發(fā)之后你的DNA就粘在那里沒(méi)用了。我們應當盡量保證DNA的良好狀態(tài)，避免破壞DNA鏈。因為如果斷裂發(fā)生在你想要研究的位置上，就會(huì )被解讀成未甲基化的胞嘧啶而產(chǎn)生錯誤的結果。”Messerschmidt等人最近會(huì )在Nature Protocols上發(fā)表一篇文章，詳細闡述這個(gè)方案的細節之處。

     日本九州大學(xué)的Hiroyuki Sasaki及其同事開(kāi)發(fā)了直接成像甲基化標簽的技術(shù)，甲基化特異性原位雜交（MeFISH）。MeFISH用熒光探針結合甲基化的胞嘧啶，很容易就能在顯微鏡下看到這些標簽，能從幾百個(gè)細胞快速得到分析數據。雖然這個(gè)技術(shù)一次只能檢測少量細胞，但它能夠區分5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。上文提到的重亞硫酸鹽測序法都不能區分這兩種表觀(guān)遺傳學(xué)修飾。