骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)是最常見(jiàn)的成體干細胞,其操作流程比較穩定和成熟。即以BMSC為例,初步闡述成體干細胞具體應用步驟與流程。
(一)骨髓基質(zhì)干細胞分離培養的準備工作
1.配制DMEM培養液
取DMEM培養基10g,NaHC03 2.2g,L-谷氨酰胺300mg,維生素C 37.5mg,青霉素10萬(wàn)單位,鏈霉素10萬(wàn)單位,加適量三蒸水充分溶解后,調節pH值至7.4,補三蒸水至900m1。經(jīng)無(wú)菌0.22btm過(guò)濾器過(guò)濾后,加FBSl00ml,4℃保存。
2.配制胰蛋白酶-EDTA消化液
稱(chēng)取胰蛋白酶0.125g,EDTA 0.01 g,適量PBS充分溶解,調pH值至7.4,補三蒸水定容至100ml,0.22um過(guò)濾器過(guò)濾除菌,分裝,4℃保存。
3.配制Percoll分離液
Percoll原液與1.5mol/LNaCl以9:1比例稀釋。
4.配制成骨誘導培養液
DMEMlog/L,p-磷酸甘油鈉10nmo/L,地塞米松10nmol/lL-a-磷酸抗壞血酸50btmol/L,L-谷氨酰胺300mg/L,l,25(OH)2-維生素D3 10nmol/L,10%胎牛血清。
5.配制成軟骨細胞誘導培養液
DMEM 10g/L,地塞米松10 nmol/L,L-α-磷酸維生素C 50 umol/L,L谷氨酰胺300mg/L,TGF-βl 10ng/ml,IGFl00ug/ml,10%胎牛血清。
6.配制成脂肪細胞誘導液
DMEM 10g/L,10%FBS,1-甲基-3-異丁基黃嘌呤0.5mmol/m1,地塞米松1mmol/m1,胰島素10ug/m1,吲哚美辛100mmol/m1。
(二)骨髓基質(zhì)干細胞的分離與培養
1.人骨髓的抽取
成年志愿者應無(wú)系統性疾病,年齡最好在20~40歲之間。所用器械預先用肝素潤濕,10m1注射器吸人1ml肝素化PBS(1 000U/ml)。骨髓提供者仰臥位,髂前上棘常規消毒、鋪巾,用2%利多卡因局部浸潤麻醉,骨髓穿刺針垂直進(jìn)入骨髓腔中,緩慢抽取2m1骨髓,立即注入15ml離心管中(如需骨髓量多,必須重新更換穿刺點(diǎn),防止外周血造成骨髓稀釋)。動(dòng)物的骨髓穿刺過(guò)程基本相似。
2.BMSC的分離
采用密度梯度離心法。骨髓以24號注射針頭反復吹打成單細胞懸液,600g離心5min,小心吸去上層懸浮脂肪。離心管中預置Percoll分離液,Percoll原液比重1.13g/m1,用0.9%生理鹽水調整至密度1.073g/m1。注意將骨髓沿管壁緩慢滴加入Percoll液面上,兩者(骨髓:Percoll)體積為l:2;900g離心30min??梢?jiàn)離心管中液體分為5層,毛細吸管吸取percoll層上云霧狀有核細胞層,加入PBSloml,600g離心15rain,棄上清液獲取有核細胞,細胞計數。以lXl0’/cm2密度接種于培養皿,加入10 m1低糖DMEM培養液,37℃,叵溫,在5%C O2 、95%O2 混合氣體環(huán)境中培養。
3.BMSC原代培養
原代細胞接種后,每天倒置顯微鏡觀(guān)察細胞貼壁情況,根據細胞貼壁情況,于接種后2~5天換液。換液時(shí)先輕輕搖動(dòng)培養皿,使未貼壁的紅細胞浮起,吸除含大量紅細胞的培養液,PBS洗滌2~3次。此時(shí)在低倍鏡下可清楚地見(jiàn)到多個(gè)克隆形成,加入新鮮培養液,繼續在相同的條件下培養。原代細胞一般于7~14天達到80%融合,傳代培養。
4.BMSC消化傳代
吸去培養液,加入PBS 10 m1,清洗2遍;吸盡PBS后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA4m1,37~C放置2rain;待細胞變圓形浮起,加人含血清的培養液4m1,終止消化。收集細胞到離心管內,l 500r/min離心5min,吸去上清液;加入10mlPBS,漩渦振蕩器內混勻,臺盼藍染色觀(guān)察軟骨細胞活力,血細胞計數板計數。以4X10’/cm2接種到10cm培養皿培養,加入10ml培養液,37~C恒溫培養。
5.BMSC多向誘導實(shí)驗
傳代培養時(shí)分別采用以上配制的成骨、成軟骨細胞、成脂肪細胞誘導液培養,倒置顯微鏡觀(guān)察細胞形態(tài),培養皿底部預置玻片用于檢測。對照組仍用含10%FBS的DMEM培養液培養與傳代,與誘導組同期傳代,同期觀(guān)察。