非病毒載體介導的基因治療有許多優(yōu)點(diǎn)，但就目前大多數表達體系而言普遍存在外源基因表達水平低而短暫等問(wèn)題為了使外源基因穩定持續表達，必須對質(zhì)粒DNA 進(jìn)行改造。附著(zhù)體質(zhì)粒載體(episomal vector)可以使外源基因以附著(zhù)體形式復制，分離到子代細胞，從而使基因高效持續表達，是種新型的非病毒表達載體。

   我們構建了以EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)復制子(EBV replicon，EBVR)為基礎的附著(zhù)體質(zhì)粒載體，并將報告基因增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein．EGFP)克隆至它的多克隆位點(diǎn)，觀(guān)察其在COS-7細胞中的表達。

   試劑

   各種限制性?xún)惹忻福?/span>T DNA連接酶、無(wú)DNA酶的RNA酶和100 bp DNAMarker；Klenow酶；Lambda DNA HindIll Marker；Trizol試劑、Taq DNA聚合酶和瓊脂糖；酵母抽提物、胰蛋白胨；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA分離純化試劑盒；Lipofectamine 2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體、Opti-MEM、DMEM培養基和M-MLV逆轉錄酶；小牛血清；G418；DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I1。

   質(zhì)粒

   pGL3-promoter；含EBVR的質(zhì)粒p220.2。

   重組質(zhì)粒載體pcDNA3-EGFP-EBVR的構建

   采用StuI和XbaI消化p220.2，獲得長(cháng)4.7 kb的EBVR，包括EBV核抗原1(EBNA1)和OriP，克隆至pGL3-promotor的SV40啟動(dòng)子下游Hind Ill(Klenow酶補平)和XbaI之間，構建重組質(zhì)粒載體pGL3-EBVR。pGL3-EBVR經(jīng)Bgl I1和BamH I雙酶切得到SV40啟動(dòng)子和EBVR片段，插入pcDNA3-EGFP(圖1A)中CMV啟動(dòng)子上游BglI1位點(diǎn)處，構建重組質(zhì)粒載體pcDNA3-EGFP-EBVR。

   重組質(zhì)粒載體pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR的構建

   采用Hindin和EcoRI消化pCL，獲得800 bp的人13-IFN基因上游IFN-MAR，將此片段克隆至pBluescript中，構建重組質(zhì)粒載體pBlue-MAR。再將MAR片段經(jīng)SalI和XbaI雙酶切插入pGL3-EBVR的EBVR片段下游，構建pGL3-EBVR-MAR。經(jīng)Hind Ill消化，Klenow酶補平，將5．3 kb的EBVR-MAR片段亞克隆入pcDNA3中CMV啟動(dòng)子上游Bgl I1與Ⅳ，MI位點(diǎn)之間，構建重組質(zhì)粒載體pcDNA3-EBVR-MAR。將聚合酶鏈反應(PCR)擴增所得的EGFP片段插入pcDNA3-EBVR-MAR的Hind11I和XhoI之間，得到重組質(zhì)粒載體pcDNA3-EGFP-EBVR-MAR。經(jīng)MfeI和EcoRI消化去除OriP片段，T 連接酶連接，構建得到重組質(zhì)粒載體pcDNA3-EGFP-EBNA1MAR。

   質(zhì)粒純化和鑒定

   所得質(zhì)粒按質(zhì)粒純化試劑盒要求進(jìn)行抽提純化。測定光密度值(D260nm )，鑒定質(zhì)粒的量和純度，酶切，電泳鑒定。

   細胞轉染

   細胞株COS-7在含10％ 小牛血清的DMEM培養液、5％CO 、37℃ 恒溫箱中培養。用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導質(zhì)粒pcDNA3-EGFP.EBVR和pcDNA3.EGFP.EBNA1.MAR轉染細胞COS.7。具體操作參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。48 h后檢測目的基因表達或以1：20傳代后加入G418(400 g／mL)篩選，每2～3天換液1次。10～14 d后抗性克隆形成，分離并擴增各單克隆細胞。分別在轉染后14、28、60 d檢測目的基因表達。

   EGFP基因表達檢測

   1．熒光顯微鏡觀(guān)察EGFP基因表達：通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察熒光細胞數及熒光強度，并攝片。

   2．流式細胞儀檢測EGFP基因表達：pcDNA3-EGFP.EBVR和pcDNA3.EGFP.EBNA1．MAR轉染細胞48 h。14、28、56、90 d后0．25％ 胰酶消化，PBS洗滌，用含1％ 甲醛的PBS固定細胞后用流式細胞儀(Becton Dickinson FACS calibui)檢測熒光細胞數及熒光強度。以未轉染質(zhì)粒DNA 的細胞作為空白對照。

   3．逆轉錄(RT)-PCR檢測EGFP cDNA轉錄：細胞轉染后14、28、60 d采用Trizol試劑抽提細胞總RNA。具體操作參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。DNase I孵育去除殘留的基因組DNA，紫外分光光度計定量后，以GAPDH基因片段作為內參照，RT．PCR檢測EGFPmRNA轉錄。EGFP引物：上游：5’GCGAAGCTTCCATGGTGAGCAAGGGC 3’；下游：5’CCAGGATCCGCCGC 兀TACTTGTAC 3’；擴增片段長(cháng)度為719 bp。GAPDH 弓I物上游：5’TGGGGAAGGTGAAGGTCGG3’；下游：5’CTGGAAGATGGTGATGGGA 3’；擴增片段長(cháng)度為233 bp。PCR擴增條件：95℃ 5 min后，94 ℃ 1min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

   細胞內Hirt’S小分子DNA抽提及分析

   按照Hirt’S方法 在轉染后14、28、60 d抽提COS．7細胞內小分子DNA。具體方法：用10 mmol／L Tris．HC1(pH 7．5，1 mmoI／L EDTA，1％ SDS，200 g／mL Pro—teinase K)1 mL裂解5×10。個(gè)細胞，37℃ 保溫2 h；裂解細胞液內加入5 mol／L NaC1 0．25 mL，輕輕混勻，4℃ 過(guò)夜；4℃ 離心，15 000×g 30 min；取上清，酚一氯仿抽提，乙醇沉淀，20 TE液(pH 8．0，10 mmol／L Tris—HC1，1 mmoI／L EDTA，25 g／mL無(wú)DNase的RNase)溶解。為了鑒定獲得的Hirt’S小分子DNA的完整性，取出5 μL，電穿孑L法轉化大腸桿菌JM109，還原質(zhì)粒。觀(guān)察所得細菌克隆數，并挑取轉化克隆質(zhì)粒小量制備。以原始質(zhì)粒作為對照，適當限制性?xún)惹忻该盖校?/span>0．8％ 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

   Southern印跡分析

   取抽提所得小分子DNA10  μL，XhoI酶切，1％ 瓊脂糖凝膠電泳。毛細管法將DNA轉移到尼龍膜上。pcDNA3-EGFP 10 Ixg采用Hind11I和BamHI進(jìn)行酶切，電泳，回收719 bp EGFP片斷，取1 g按試劑盒說(shuō)明用DIG-High Prime進(jìn)行DNA探針標記。按DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter KitⅡ說(shuō)明進(jìn)行預雜交、雜交及化學(xué)發(fā)光檢測。